干貨,一文讀懂抗體依賴細胞毒作用(ADCC)及相應個體推薦

2019-03-12 19:08 嚴國樑
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【ADCC是現在很多抗體藥物發揮藥效的重要方式,相關實驗也是研發人員經常接觸的,雖然現在有基因改造的Jurkat細胞株,但在實際操作過程中仍舊離不開PBMC,畢竟其更能模擬人體內的ADCC效應。但使用PBMC,存在Fresh PBMC來源不穩定,使用不方便,個體差異巨大的問題。

本文詳細介紹了ADCC的相關作用機理,常見的檢測方法,并且最后推薦了已經經過很多制藥客戶驗證的適合ADCC實驗的冷凍PBMC批次,可以有效確保實驗的穩定性


當抗體通過抗原結合部位結合腫瘤細胞表面抗原以及Fc部位結合免疫效應細胞表面FcR時,免疫效應細胞得到激活,殺死腫瘤靶細胞, 這 個 過 程 稱 為ADCC。人 的 IgG抗體通常IgG1最高。 Fc受體主要 有3FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)FcγRIII (CD16) 。其中后面兩種低親和力的受體可以進一步細分為FcγRIIa(激活性受體)、FcγRIIb(抑制性受體)和 FcγRIIc(激活性受體),以 及FcγRIIIa(激活性受體)和 FcγRIIIb( 沒有胞內區,通過糖基磷脂酰肌醇錨定在細胞表面)。不同的免疫細胞種群表達特定的Fc受體,例如中性粒細胞通常表達FcγRI、FcγRIIFcγRIIIb,而NK細胞只表達低親和力的FcγRIIIa。FcγRIIIa通常認為是引起ADCC的關鍵受體,所以雖然NK細胞,單核巨噬細胞和中性粒細胞都可以產生ADCC作用 ,但是NK細胞認為是其中最重要的細胞種群。激活的NK細胞分泌穿孔素和顆粒酶等細胞毒顆粒直接殺死腫瘤靶細胞,同時也分泌IFN-γ等細胞因子和化學因子來調控其他免疫細胞。

雖然許多抗腫瘤抗體在體外都顯示ADCC作用 ,但是 ADCC這一作用機制與臨床有效性之間的關聯還沒有得到完全證實。Clynes等人通過比較幾種臨床有效的抗體對接種于野生型小鼠和FcγRII/III基因敲除小鼠體內的人異體移植腫瘤的療效,對Fc受體相互作用的重要性進行了評價。這些抗體在FcγR基因敲除小鼠體內的療效遠不如野生型小鼠,但是在只敲除了抑制性FcγR的小鼠體內療效得以保持甚至增強。這些結果表明抗體與Fc受體相互作用是抗體在小鼠體內抗腫瘤有效性的基礎,并且對某些抗體在臨床上的有效性也具有重要作用。在 對rituximab的臨床研究中發現,某些淋巴瘤患者的治療效果遠遠好于其他患者。后經分析發現,這些高應答個體患者都具有相同的Fc受體多態性。人的CD16蛋白由于在158位氨基酸是纈氨酸(V)或苯丙氨酸(F)而呈現兩種多態性,CD16-158VCD16-158F。CD16-158V與抗體Fc部位的親和力高于CD16-158F。帶有CD16-158V/V純合體的患者比帶有CD16-158F/F純合體以及V/F雜合體的患者對rituximab更敏感,其腫瘤治療的預后也更好。這些研究表明抗體Fc部位和Fc受體的相互作用至少在一定程度上是rituximab臨床療效的基礎,同時也顯示了 ADCC的重要性。在transtuzumab治療的患者腫瘤部位發現了明顯的NK細胞浸潤以及增強的淋巴細胞活性。后續研究表明,NK細胞在transtuzumab 介 導 的ADCC中起關鍵作用。transtuzumab治療敏感的HER2/neu陽性早期乳腺癌患者較不敏感患者表現顯著增強的ADCC,而且這個介導的細胞毒作用強度與腫瘤病灶的縮小具有顯著的關聯性。CD16-158V/V的乳腺癌患者對transtuzumab治療具有較高的客觀有效率以及無進展生存期。


單克隆抗體介導的ADCC強弱跟許多因素有關,比如抗體與抗原的親和力,抗體與 Fc受體的親和力、腫瘤抗原的密度、腫瘤靶細胞的特性以及免疫效應細胞的特性等。 般情況下 ,腫瘤靶細胞與免疫效應細胞通過抗體的橋聯結合越緊密,ADCC作用越強。因此,對抗原或Fc受體親和力高的抗體介導的ADCC作用更強。表達靶抗原高的腫瘤細胞對ADCC更為敏感,容易被ADCC作用所殺死。但是我們在實踐中也發現一些高表達抗原的腫瘤細胞對ADCC表現出抗性,這可能與腫瘤細胞的本身特性有關,比如下調與免疫突觸形成有關的黏附分子,上調與細胞修復有關的蛋白等。同 時,免疫效應 胞本身的特性也影響ADCC,比如NK細胞表達的Fc受體的多態性,對免疫調節因子的反應性等。改造抗體,提髙其對抗原或Fc受體的親和力,可以提高抗體介導的ADCC作用 ,這是提高抗體抗腫瘤活性的直接、快速和有效的一個途徑。

提高抗體對抗原的親和力可以通過體外親和力成熟來實現,這一過程主要是在體外模擬體內抗體的親和力成熟過程。具體的方法手段有很多,包括噬菌體、核糖體、酵母表面呈現 ,以及傾錯PCR和鏈替換等,這里不一一詳述。


提髙抗體對Fc受體的親和力可以通過改造抗體Fc部位的糖基化和氨基酸序列來實現。位于IgG抗體CH2結構域297位的天冬酰胺是一個保守性的氨基酸,其糖基化對于抗體與Fc受體的相互作用很關鍵。IgG-N297N-連接的低聚糖通常是一個復合型結構,由甘露糖化-殼二糖核心(Man3GlcNAc2-Asn)外加不等的平分型乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc) 、核心巖藻糖、非還原性末端Gal和唾液酸組成。對一系列截短糖基IgG的研究顯示,Fc部位低聚糖的α(1-6)結構的糖殘基與CH2結構域內表面的非共價相互作用決定了蛋白-低聚糖復合物的整體構象。如果逐漸截短低聚糖組成,一個類似于馬蹄型的結構就會顯露出來。當低聚糖截短到三糖時,其結構完整性和功能性都下降。當進一步截短到只剩最初的N-乙酰葡萄糖胺殘基時,其功能性完全喪失。核心β-甘露糖殘基上的平分型GlcNAc對抗體的生物學活性,尤其是ADCC的影響比較大。從 N-乙酰氨基葡萄糖基轉移酶IIIGnTIII轉染的CHO細胞中產生的抗體含有大量的平分型GlcNAc。這種抗體較普通抗體的ADCC活性強10倍 。過多的唾液酸殘基降低抗體與Fcr/REIa及抗原表面的結合,從 而 影 響 ADCC活性。在所有的糖組分中,巖藻糖被認為是影響ADCC活性的最重要的糖。去掉巖藻糖可以顯著提高抗體與FcγRIIIa的親和力及ADCC活性。研究顯示,不論抗體識別的抗原是什么,抗體的種屬來源和亞型是什么,其Fc部位的去巖藻糖化都可以提高ADCC活 性 高 至 100多倍,同時也提高了體內抗腫瘤活性。由于目前幾乎所有商業化的治療用抗體都是利用哺乳動物細胞大規模發酵產生,而且α-1,6-巖藻糖基轉移酶(FUT8) 是催化低聚糖巖藻糖化的關鍵酶。所以,抑制或者完全消除生產細胞株的FUT8活性 ,就可以很容易得到去巖藻糖化的抗體。目前巳經有研究小組獲得了FUT8基因敲除的CHO細胞株。這一改造后的CHO細胞除了沒有FUT8基因表達外,其他如細胞形態、生長動力學、蛋白產量等與野生型CHO并無不同。用 這種FUT8缺陷的CHO細胞產生的抗體不含巖藻糖殘基 ,具有很強的ADCC活性。

目前,對于突變Fc部位的氨基酸序列以獲得可以介導高強度ADCC的抗體研究得比較充分。通過引入不同的點突變改造人IgG Fc部位的氨基酸,再測定這些突變抗體的親和力及介導ADCC的能力,研究人員初步繪制出了人IgG,抗體與不同的激活性Fc受體和抑制性受體FcγRIIb的結合圖譜。當 Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(喪失糖基化)和Pro329氨基酸殘基被突變成為丙氨酸時,IgG1于所有FcR的親和力都下降。所有這些氨基酸殘基都位于IgG CH2結構域靠近CH1、CH2鉸鏈區。這一區域連同其前端的鉸鏈區共同構成IgG1Fcγn 的結合部位。對于FcγRIIIa而言 ,擁有3個突變(S298A、E333A、K334A) 的抗體顯示最強的結合能力和介導ADCC的能力。另外一個研究小組應用酵母呈現系統篩選了大量Fc突變體,發現一個擁有5個突變 (F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L) 的突變體對FcγRIIIa的親和力提高了 10倍 ,同時也具有更強的ADCC活性?;?/span>Fc-FcγR結合面的結構信息,運用計算設計和高通量篩選評估技術發現, IgG1 Fc突變體(S239D、A330L、I332E)FcγRIIIa的親和力提高了100倍 ,但是對抑制性受體FcγRIIb的親和力提高有限。因此,這一突變抗體在體外和食蟹猴體內都介導很強的ADCC活性。

通過對抗體的改造獲得具有更強ADCC活性的強化抗體, 具有顯著的臨床應用價值。一方面,一些原本對野生型抗體不敏感的抗原低表達腫瘤對強化抗體治療敏感。另一方面,帶有FcγRIIIa 158F多態性的低應答患者在使用強化抗體時可能產生有效應答。同時,強化抗體的使用劑量也可以縮減,同樣可以達到髙劑量野生型抗體的療效。這可以大幅減低抗體的使用劑量,降低醫療成本。然而 ,強化抗體也會產生副作用,比如一些低表達抗原的正常組織細胞也會受到強化抗體的作用,但不會受到野生型抗體的作用。不論是點突變改變氨基酸,還是改變糖基結構,都是人工改變了野生型抗體的結構,增大了應用于人體時導致抗抗體產生的可能性。



體外檢測ADCC效應有以下幾種方法。


1.1通過檢測乳酸脫氫酶的釋放,檢測靶細胞的死亡量

此方法利用熒光分析法檢測多孔板中死亡細胞的數量。它通過測定損壞的細胞膜中釋放出來的乳酸脫氫酶(LDH)。產生的熒光量與裂解的細胞數量成正比。酶學反應對正常的健康細胞無任何損傷,因此檢測可在正常細胞與死亡細胞的混合物中完成。這是傳統的用于檢測ADCC的方法,操作比較簡便,但缺點是靶細胞沒有被標記,檢測結果不能區分靶細胞和效應細胞的LDH釋放。

操作過程:準備好靶細胞加入到96孔反應板中,然后再加入按比例稀釋好的陽性對照抗體和樣品,孵育一定的時間,將準備好的效應細胞(NK92/CD16A細胞或者從血里提取的PBMC)加入到對應孔中孵育一定的時間,孵育完后酶標儀讀取熒光,對于不同靶細胞,不同的抗體的LDH檢測方法:效應細胞和靶細胞的比例以及孵育時間都需要重新優化。


1.2 BATDA 標記靶細胞,通過檢測熒光的強弱,檢測靶細胞的死亡數量

 此方法是用熒光增強配基-BATDA 標記靶細胞,疏水的配基BATDA能夠自由透過細胞膜,進入細胞膜后BATDA被水解形成親水的配基TDA,不易透過細胞膜。當靶細胞被效應細胞裂解后,TDA漏出細胞膜,加入Europium Solution,形成強熒光的穩定金屬螯合物:Eu-TDA。這是一個時間分辨熒光強度實驗,所以需要測TRF(Time-Resolved Fluorescence)。


圖3:BATDA 標記細胞及檢測原理

 圖4: BATDA 標記靶細胞及其檢測ADCC 的 基本過程


此方法的操作方法與檢測乳酸脫氫酶的方法的類似,只是多了一步靶細胞的標記和洗滌的過程。

此方法的優點是靈敏度高,熒光信號穩定,非放射性,缺點是操作比較復雜,由于標記靶細胞會對細胞有一定毒性,對于一些比較敏感的靶細胞被標記后發生大量自我死亡。對檢測殺傷產生影響。


此方法需要優化的條件:不同靶細胞BATDA 標記的時間,不同靶細胞標記所需要的BATDA的濃度;不同靶細胞不同抗體:效應細胞和靶細胞(NK92細胞或者PBMC)的比例,效應細胞與靶細胞,抗體的孵育時間需要優化。


1.3 Calcein-AM 標記靶細胞,通過檢測熒光的強弱,檢測靶細胞的死亡數量

Calcein-AM 也是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑,它在Calcein(鈣黃綠素)基礎上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基團,增加了疏水性,使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后,Calcein-AM(本身不發熒光)被細胞內的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein,從而被滯留在細胞內并發出強綠色熒光。Calcein 標記后可以用兩種方法檢測殺傷效果,一種是Calcein-AM release assay,用酶標儀讀取死亡細胞釋放至上清的熒光量即靶細胞的死亡量;另一種是 Calcein-AM retention assay,用流式細胞儀檢測滯留在靶細胞內的Calcein 綠色熒光信號的強弱從而檢測活細胞的數量。


1.3.1 Calcein-AM release assay,用Calcein-AM標記靶細胞后,加入抗體和效應細胞,孵育一定時間,用酶標儀讀取熒光。每個細胞不同的抗體,效應細胞和靶細胞的比例以及孵育時間都需要重新優化。此方法的優缺點以及需要優化的條件同BATDA 標記靶細胞的方法一樣。

1.3.2 Calcein AM retention assay

Calcein AM retention assay 前期的標記靶細胞及與抗體效應細胞的孵育的操作同release assay一樣, 只是最后通過流式細胞儀檢測。


1.4 ADCC 報告基因生物活性檢測

ADCC報告基因生物活性檢測即ADCC Reporter assay,它的操作過程和前面提到的幾種ADCC的方法一樣。待檢測的抗體和表達相應靶點的靶細胞結合。然而在檢測報告基因的實驗里,需要用到工程T淋巴細胞-表達FcγRIIIa 受體的Jurkat 細胞而不是NK細胞。報告基因檢測法的優點是,效應細胞Jurkat 細胞培養簡單,實驗程序操作簡單,實驗穩定性好,背景低等。缺點是它不是模擬體內ADCC作用過程,此方法可以用作前期的抗體篩選階段,但是到后期確定抗體功能,還是需要效應細胞為PBMC的方法,更能模擬人體內ADCC作用過程。在這個過程中,Fc段與Jurkat 細胞上的FcRIIIa受體結合,FcRIIIa受體的活化能夠引起nuclear factor of activated T-cell(NFAT)信號通路的活化,啟動熒光素酶報告基因的表達。一旦靶細胞被裂解,熒光素酶和熒光素和ATP相互反應,產生一種穩定光信號。這個實驗是一個"加樣-混合-讀數"的檢測模式極大減少了操作步驟,不需要離心和轉板。


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20190410