一文解讀PBMC:藥物研發的最佳搭檔

2019-05-27 10:31 嚴國樑
14423


Origin of Peripheral Blood Mononuclear Cells

外周血單個核細胞(PBMC)來源于骨髓中的造血干細胞
(HSC)。
HSC通過造血過程產生免疫系統的所有血細胞。HSC可以分化成兩個譜系:髓系
(單核細胞、巨噬細胞、粒細胞、巨核細胞、樹突狀細胞、紅細胞
) 和淋巴系
(T 細胞、
B 細胞、NK 細胞) (如圖1,2)。



PBMC是具有圓形細胞核的血液細胞, 在上述兩個譜系中都有構成PBMC的相關細胞,是由不同構成比例的淋巴細胞 (T細胞、B細胞和NK細胞)、樹突狀細胞和單核細胞組成的細胞群 (1)。這些細胞是先天免疫和適應性免疫系統的關鍵組成部分, 可以保護身體免受病毒、細菌和寄生蟲的感染和異物侵擾, 并且能夠消滅腫瘤細胞。


Table 1.
Average cell frequencies from enriched PBMC fractions.


The Frequency of Different Cell Populations within the PBMC Fraction

PBMC中不同亞型比例因人而異,但平均而言,淋巴細胞占PBMC的大多數(70%-90%)。淋巴細胞在細胞介導和體液免疫反應中起著至關重要的作用, 主要與TB細胞的激活有關。在淋巴細胞群體中,CD3+T細胞占了整個PBMC的
45-70%。大多數 T 細胞以未被抗原激活的naive
T細胞或memory T細胞的狀態存在。因而在健康的捐獻者中,已被抗原激活的T細胞僅占很小一部分。一旦T細胞被激活就會啟動細胞介導的免疫反應。


同樣, 健康捐獻者中CD19+ B 細胞主要以naive或memory
B細胞的狀態存在,等待抗原激活, 其僅占淋巴細胞總數的5-15%。一旦B細胞被激活,其可以分化為能大量分泌抗體的漿細胞, 這些抗體專門針對血液中循環的游離抗原,引發體液免疫反應。


NK 細胞在淋巴細胞群中所占比例較小 (5-10%)。NK細胞常被認為是先天免疫系統的一部分, 是屬于我們身體的第二道防御系統(第一道是由皮膚和粘膜組成的物理防線,第三道就是適應性免疫)。這些細胞在不需要抗原的情況下執行其效應功能, 并保護身體免受腫瘤活動的影響。


一小部分細胞包括樹突狀細胞 (1-2%)在先天免疫系統和適應性免疫系統之間構成重要的橋梁。樹突狀細胞是一種高度專業化的抗原呈現細胞(APC), 它吞沒抗原并將抗原片段呈現給自適應免疫系統的細胞(人HLA(MHC)分型類別及分型方法介紹,抗原介紹--從六個方面完整闡述抗原, 從而激活 T 細胞和 B 細胞。


與淋巴細胞不同,在收到刺激信號后,在血液循環中游蕩的單核細胞
(10-30%) 需要動員到組織中,并在那里成熟并分化為樹突狀細胞或巨噬細胞, 從而起到抗原提呈或細胞吞噬功能,調節先天和適應性免疫反應。


最后, 但非常重要的是造血干細胞。血液和骨髓中的HSC產生血液中的所有細胞, 包括紅血球、血小板、淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。雖然這種罕見的細胞群只占 PBMC 總量的 0.1-0.2%, 這使得它們很難以從全血樣本中分離出來。但通過注射動員劑, 如粒細胞集落刺激因子 (G-CSF) Plerixa, 可以將 CD34+ 干細胞的比例增加到 0.5-1.5%。



Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells

提取外周血單個核細胞主要有兩種方式:

1. 獲取全血隨后通過密度梯度離心(Ficoll)。常用來分離人外周血單個核細胞(PBMC)的Ficoll液密度為 1.077±0.001 g/ml,紅細胞、粒細胞由于密度較大,離心后沉于管底;淋巴細胞和單核細胞的密度小于或等于分層液比重,離心后漂浮于分離液的液面上。吸取分層液液面的細胞,就可從外周血中分離到單個核細胞。見Figure 3:


Figure 3. Whole blood layered onto a density gradient medium. After centrifugation, the PBMC fraction is defined by the white layer at the interface between the plasma and the density gradient medium.


2. 用單采機直接采集單個核成分血(一次提取10000000000的PBMC.......把人抽干的節奏????。?!):單采機是一種自動化設備, 它使用高速離心將PBMC直接分離, 同時將血漿、紅血球和粒細胞等回輸給捐獻者,從而確保了采集過程中獻血員血容量始終保持平衡,對其心血管系統影響小,更為安全。平均而言, 通過單采得到的PBMC比全血密度梯度離心過程多14倍(見Figure 4),且捐獻者可間隔30天重復捐獻,一年最多可捐獻12次,這使其成為大規模研究或臨床前試驗的理想選擇??蛻艨梢愿鶕嶋H實驗, 進一步離心以去除殘留的紅血球 (RBC裂解) 和粒細胞 (密度梯度離心)。


Figure 4. PBMCs were collected from 8 different donors per collection group (Leukopak?
and Whole Blood) and counted using a hemocytometer to determine cell yield.



Peripheral Blood Mononuclear Cells in Research

PBMC是免疫系統的關鍵組成部分,因此在免疫學、傳染病、惡性腫瘤、疫苗研發、移植治療、個性化醫學和毒理學等領域作為最基礎的實驗原料被廣泛使用。


如現在大家在腫瘤免疫藥物研發中常見的體外實驗(免疫檢查點藥物研發--PBMC相關體外實驗):MLR, SEB,ADCC抗體依賴細胞毒作用(ADCC), T細胞激活或抑制,CMV Recall, Treg抑制等(見下圖)和PBMC構建的人源化小鼠(常見的免疫系統人源化小鼠模型介紹








同時基于PBMC的研究也正在擴展到精準醫學。從單供者的PBMC中誘導得到的多能干細胞 (iPSc) 對疾病建模、藥物毒性篩查、藥物發現和細胞替代療法的個性化醫學具有重要意義。使用基因組編輯技術, CRISPR/Cas9, 可以將免疫細胞 (如來自PBMC的T細胞) 轉化為通用型CAR-T 細胞, 從而能夠在沒有供體匹配的情況下治療癌癥。



How to Choose the Fresh or Frozen PBMC

新鮮PBMC相對于冷凍PBMC而言,確實有其優勢:

1. 細胞冷凍復蘇難免會對其活性造成影響,死亡的細胞及碎片可以靠離心去除,但復蘇后狀態較差的細胞會影響自身及周邊細胞的功能,因而對實驗造成干擾;


2. 由于PBMC中含有一些含量非常低的細胞(如CD34+),冷凍復蘇會對這類本身含量就很稀缺的細胞造成較大影響;


不過現階段由于國內法律禁止任何的血液買賣和繞開血站或醫院私下有償采集血液(黑金——血液買賣——艾滋村),因而樣本來源困難,抑或來源完全不合規且供應商對來源渠道均諱莫如深,這就容易導致以下的問題:


1. PBMC質量及服務的良莠不齊。樣本源頭就很難保證,何談確保PBMC的質量穩定性,同時供應時間常常不穩定,實驗需要跟著供應時間走;


2. 更加嚴重的是由于血液本身為敏感傳染源,基于來源的不透明不穩定,很難確保病毒檢測的百分百可靠性,這也給實際操作人員帶來巨大的實驗風險;


3. 產品無法溯源,無法提供可用于申報的合規的倫理、知情,留下后患;


4. 同時很多所謂的新鮮產品事實上已經不是真正的Fresh:經過實驗發現,對于PBMC而言,離體之后越快冷凍越能保證其活性及功能。當采購PBMC時,使用當天分離并即刻冷凍的PBMC對實驗更為理想。當從靜置24h后的Leukopak(模擬運輸環境)中分離得到的PBMC,其組分中T細胞和NK細胞含量會發生明顯變化,同時對刺激反應弱化。如果是從全血中提取PBMC,當全血離體一段時間后,再使用Ficoll進行分離,最終得到的細胞層中中性粒細胞含量會明顯增高,根據文獻報道,這是因為中性粒細胞離體后會被活化,而這會影響中性粒細胞的密度,因而會嚴重影響密度梯度離心得到PBMC的效率(How Fresh Are Your PBMC?)。


從現階段大量客戶的反饋來看,對上文中提到的所有實驗,使用冷凍PBMC是完全可行的方案,且冷凍PBMC優勢較為明顯:


1. StemExpress國外原裝進口的冷凍產品均有倫理及知情,免除后顧之憂;


2. 每個donor均進行完善的病毒檢測,真正做到了用的放心;


3. 細胞復蘇活性可以保證,一般復蘇活性>90%;


4. 可根據實驗需要挑選特殊個體(人種,性別,HLA-typing,CMV情況等);


5. 減少個體差異,保證實驗的連續穩定,單一donor一次捐獻可以提取50管100million產品,且可間隔30天重復抽??;


6. 冷凍細胞液氮保存即可,隨用隨取,可任意安排實驗時間;


7. 提供磁珠分選好的亞型細胞,特別是對于Treg這類含量很少的細胞,由于國外能夠得到的PBMC量巨大,因而可以得到的單個個體來源的稀缺細胞數量亦較大;



Conclusion

PBMC是與人類健康和疾病有關的研究和臨床研究的有力工具。通過對PBMC的研究, 研究人員和臨床醫生可以測試免疫反應, 更深入地了解免疫系統, 并將發現應用于人類疾病的治療。


儒百生物聚焦于血液免疫學產品,獨家代理美國StemExpress全套血液免疫學產品(外周血、骨髓、臍血、動員外周血),致力于為各位提供高質、穩定的血液相關細胞,真正做到

No Worry For Your Cell Again!


參考:

1.StemExpresshttps://www.stemexpress.com/blogs/peripheral-blood-mononuclear-cells/

2.Wang, C., et al. (2014). "In Vitro Characterization of the Anti-PD-1 Antibody Nivolumab, BMS-936558, and In Vivo toxicology in Non-Human Primates."
2(9): 846-856.

3.Maximizing PMBC Recovery and Viability: A Method to Optimize andStreamline Peripheral Blood Mononuclear Cell Isolation,Cryopreservation,and Thawing: www.bioprocessintl.com/manufacturing/cell-therapies

4.McKenna KC, et al. Delayed Processing of Blood Increases theFrequency of Activated CD11b+ CD15+ Granulocytes Which Inhibit T Cell Function.J. Immunol. Meth. 341, 2009: 68–75.

5.DeRose R. Granulocyte ContaminationDramatically Inhibits Spot Formation in AIDS Virus–Specific ELISpot Assays:Analysis and Strategies to Ameliorate. J. Immunol. Meth. 297, 2005:177–186.

6.How Fresh Are Your PBMC by Astrobio


后續小編準備圍繞我們的PBMC,一次介紹一種細胞(如DC, Treg, CD8, CD4,NK等),感興趣的可以關注我司公眾號


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