一文解讀DC:最佳的抗原遞呈細胞

2019-06-16 17:22 嚴國樑
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【上一篇聊到了我司的PBMC(一文解讀PBMC:藥物研發的最佳搭檔),后續我們就圍繞著PBMC的家族成員一個一個來介紹,這次先介紹DC細胞,作為最重要的抗原遞呈細胞,并且高表達PD-L2,在常見的MLR, Treg抑制,SEB等體外實驗中常常能看到它的身影】


樹突狀細胞(DC)由諾獎得主拉爾夫斯坦曼于1973年在小鼠脾臟中發現,因其細胞膜伸出許多類似于神經細胞的樹突故而得名。DC細胞作為最重要的抗原遞呈細胞(APC),在先天免疫和適應新免疫中起著重要的橋梁作用。并且隨著現在免疫檢查點藥物的火爆,DC作為激活Naive T
Cell的唯一成員,受到越來越多的關注。


DC的分類


DC其實是一類細胞的統稱,可大略分為pDC和mDC。其中mDC根據表面maker的不同又可以分為CD1c(BDCA),CD141(BDCA3)和CD16(FCγRIII)。在體外由Monocyte分化而成的DC也歸屬于mDC(如Figure1)。其中pDC的形態類似于漿細胞,而且主要通過分泌大量的IFN-α和IFN-β來抵御病毒攻擊,與我們傳統認為的DC區別較大。因而在本文中,我們僅討論mDC。



Fig. 1. Preparation of a DC Vaccine
in vivo and in vitro.

Dendritic cells differentiate in vivo to form defifined subsets with functional specialisation. These pre-formed DC or monocytes can be purifified directly from the blood using
mAbs and magnetic selection, plate-based adherence, or purifification by density gradients. While pre-formed blood DC need then only to be activated and exposed to antigen,
monocytes need to fifirst be cultured with GM-CSF and IL-4 to form DC prior to activation and antigen exposure. Delivery is then required such that DC can reach the lymph
node, the site where they can optimally prime T cells and generate an anti-tumour response.


DC的激活

在正常組織中,樹突狀細胞為重量級吞飲者,它們每小時可吸收4倍于其體積的細胞外液。通常,它們僅只是把細胞外液吞飲進去,然后將其吐出細胞外。在這一靜息狀態,樹突狀細胞表面表達有一些B7分子和相對低水平的MHC分子。因此,靜息態樹突狀細胞不擅長于提呈抗原至T細胞,尤其不擅長于將抗原提呈至Naive
T細胞——激活
Naive
T細胞需要有
MHC-多肽復合體及強有力的共刺激信號。


一旦有微生物入侵,樹突狀細胞定居的組織將成為戰場。樹突狀細胞可以被其它免疫細胞的信號激活,如中性粒和巨噬細胞在吞噬微生物時釋放的TNF,或被微生物殺死的其它正常細胞釋放的化學物質。同時樹突狀細胞也可以通過模式識別受體(如Toll樣受體)來識別病原相關分子模式的識別分子來激活。



DC的游走


通過上面所述的細胞因子,死亡細胞釋放的化學物質,模式識別受體結合或這些信號的共刺激,原先作為“重量級吞飲者”的DC細胞將發生顯著的改變?,F在DC細胞不再做“吞進吞出”的動作,而是在接下來的將近6個小時內,大量吞噬以獲取足量的抗原標本,從而以快照的形式抓拍正在前線發生的事情,隨后隨著淋巴系統轉移到最近的淋巴結。正是這種“一經戰斗信號刺激即游走”的能力使得樹突狀抗原提呈細胞如此特別。


DC的抗原提呈


在靜息狀態樹突狀細胞內有大量的 MHCⅡ分子正等候著被裝載。當靜息樹突狀細胞被激活時,這些“儲備”的 MHCⅡ分子與來自戰區的抗原裝載。當樹突狀細胞抵達目的地時,這些裝載抗原的MHCⅡ分子被展示于樹突狀細胞表面。同時在游走過程中,樹突狀細胞上調MHCⅠ類分子的表達。因而,當樹突狀細胞在戰區被病毒或寄生物感染時,由這些侵襲寄生物產生的蛋白片段可以在淋巴結中由MHCⅠ類分子有效提呈,最后,在游走過程中,樹突狀細胞也增加B7共刺激蛋白產生。所以,當抵達淋巴結時,游走樹突狀細胞已具備激活Naive
T細胞所必需的一切條件——高水平的
MHCⅠ類和Ⅱ類分子及足夠量的B7蛋白。


由于淋巴結是T細胞的聚集點,游走的樹突狀細胞可以將從戰區攜帶的抗原片段提呈給Naive
T細胞??偠灾?,只要戰斗還在繼續,機體就需要DC游走并提呈抗原。如果感染嚴重,產生大量的細胞因子,就會有大量的樹突狀細胞開始遷移。而且,在離開組織之前,樹突狀細胞產生特殊的細胞因子(亦稱趨化因子)來影響前體細胞 (單核細胞),使其離開血液,進入組織,且成為樹突狀細胞。因而,激活的樹突狀細胞可募集自身替代者。這些新抵達的樹突狀細胞繼而被激活,并被派遣至淋巴結,從而擴大了針對入侵的免疫應答。另一方面,如果攻擊相對溫和,則戰斗性細胞因子的產生相對較少,相應地,也有較少的樹突狀細胞參與游走,替換補充者也較少。由于在淋巴結中被激活的
B細胞和T細胞的數量取決于攜帶有戰斗信息的樹突狀細胞,因此建立了一個“懲罰措施與犯罪行為相適應”的系統,使免疫應答的強度取決于感染的嚴重性。 一旦激活(免疫學家通常稱其為“成熟”)的樹突狀細胞抵達淋巴結,它們僅存活數天,這保證了由樹突狀細胞所攜帶的戰斗“信息”總是最新的。


DC的體外誘導


1.按照標準方法復蘇冷凍PBMC,并用磁珠法提取CD14細胞;

2.將CD14+細胞濃度調整為0.5million/ml。此濃度可根據您的實際情況進行調整;

3.添加IL4+GM-CSF,在37°C,5%的二氧化碳條件下培養;細胞密度為1–2.5 x 105/ c㎡;培養5天后用于實驗;

5.3-4天更換一次培養基,去除一半的培養基,換成等量的新鮮培養基。

6.細胞收集

a) 收集培養基并裝入試管中。立即將PBS添加到貼壁細胞中,上下移動移液管沖洗培養皿表面并收集入試管;

b) 向培養皿中加入PBS,并將培養皿置于37°C的培養箱中10-15分鐘。在此期間,細胞應開始從培養皿表面脫離。當用相差顯微鏡觀察時,它們變得更圓、更亮。

c) 將PBS中的細胞與a中的細胞混合;


當然對于第一步我們也可以選擇使用貼壁法直接獲得DC,而不必再去使用CD14磁珠分選,這樣得到的DC純度會低一些,但后續再用LPS或其它激活,純度會提高。同時這樣得到的最終DC含量會高于用磁珠分選,畢竟分選會損耗一批CD14細胞。


針對有些客戶認為使用冷凍PBMC分化DC可能不好的問題,其實現階段完全沒有必要擔心,已經有大量客戶在使用冷凍PBMC分化DC,完全不影響實驗結果。



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DC和癌癥


腫瘤可以通過一些方式來逃避效應T細胞的殺傷,包括1、現在最火爆的免疫檢查點(PD-(L)1,LAG3, TIM-3等);2.腫瘤特異性新生抗原耐受;3.低免疫原性,包括腫瘤低表達MHC-I分子;4.腫瘤微環境中的免疫逃逸(TAM,MSDS,Treg等)。由于DC作為唯一能夠激活Naive T cell并在前天和適應性免疫中起橋梁作用的細胞,在上述的幾個常見逃逸機制中都起到重要作用。


談到樹突狀細胞與腫瘤,就無法避開“魏則西事件”的DC-CIK,這一事件對整個細胞治療行業的影響一直持續至今,這段時間才剛剛又有風聲要放開收費問題。DC-CIK的原理其實非常簡單:首先將患者自己的DC細胞提取出來在體外同患者手術切除的腫瘤組織或腫瘤相關抗原肽進行撫育來誘導DC細胞成熟,同時將患者的淋巴細胞提取出來在體外用細胞因子激活成為CIK細胞(Cytokine Induce Killer cells,主要為CD3CD56陽性的細胞),然后在體外將腫瘤抗原誘導成熟的DC細胞和CIK細胞共同培養進行腫瘤抗原呈遞來激活腫瘤抗原相應的淋巴細胞,再把它們回輸給病人體內。歸根到底就是在體外環境模擬DC抗原遞呈,激活腫瘤特異性T細胞,再將其回輸給病人進行治療。這一方法從原理上能夠講通,但臨床試驗中療效一直不佳,基本全部以失敗告終,更多的是作為免疫輔助療法使用。以這種免疫輔助療法去欺騙絕望的患者并收取高昂費用,最后人人喊打確實也不為過。


第二個跟樹突狀細胞直接相關的就是樹突細胞疫苗,目前樹突狀細胞腫瘤疫苗正在被迅速、廣泛的研究 ,并且已在動物實驗和早期的臨床實驗中取得了很有意義的結果。這些研究結果表明: 樹突狀細胞腫瘤疫苗不僅能夠誘發針對原發腫瘤的免疫應答 , 而且也能夠誘發針對轉移腫瘤的免疫應答。樹突狀細胞疫苗基于高度特異全身和局部的細胞免疫重建,因而對癌細胞清除更具靶向性,更精準高效。
同時可持續啟動以非溶胞為核心殺傷模式的清除機制,因而安全性高,最后樹突狀疫苗具有疫苗特性的長期作用,能夠實現預防和治療的有機結合。樹突細胞可通過各種方式用于癌癥疫苗接種,包括:
1.體內樹突細胞捕獲的非靶向肽/蛋白和基于核酸的疫苗;2.直接與抗樹突抗體偶聯的抗原組成的疫苗;3 .由體外產生的負載抗原的樹突組成的疫苗。



因為外周血中含有大量的Monocyte且比較容易分離純化,而且能夠高效的在體外進行誘導分化,因而現在大部分的DC疫苗使用的均為Monocyte在體外分化而成的Mo-DC。主要方法就是使用磁珠或貼壁法分離外周血中的CD14+單核細胞,隨后使用IL-4GM-CSF進行誘導分化,最后通過TLR配體或細胞因子激活成熟。當然現在有很多研究表明Mo-DC與自然DC存在差異,直接使用外周血的DC能夠起到更好的疫苗功能。

參考文獻:

1. Bryant, C. E., et al. (2019). "Dendritic cells as cancer therapeutics." Seminars in Cell & Developmental Biology 86: 77-88.

2. Lauren Sompayrac. How the immune system works. the fifth edition.



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