PBMC質檢標準大改革

2023-03-14 14:23 嚴國樑
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冷凍PBMC相對于新鮮PBMC由于具有隨用隨取和同批次數量多的優勢,在實際實驗過程中,大家也用的越來越頻繁。但在使用過程中,我們也經常聽到反饋,主要集中在兩塊:

  1. 細胞剛復蘇時候的活性非常好,但有時候養到第二天活性比較差?

2. 我明明用的是同一個批次,但結果還是飄忽不定?

其中問題1肯定是凍存導致的問題,問題2是分裝工藝的問題。我們實驗室針對這兩個問題也做了很多探索。

一、細胞冷凍導致的延發性細胞死亡

關于這塊其實有比較多的文獻報道,也有專門的術語(CIDOCD).

Often cells appear healthy and viable when examined immediately after thawing; however when examined 24–48 h later, a signifi cant portion (30–70 %) of these cells are lost due to cryopreservation-induced delayed-onset cell death (CIDOCD) This phenomenon has been reported in many cell systems and demonstrates that while the cryopreservation process may be optimized to protect cells structurally, it
fails to adequately manage the other stresses associated with this process.

  1. 對凍存的PBMC而言,我們建議以過夜后的活性作為質檢標準,而不是以剛復蘇的作為質檢標準。其次

  2. AO/PI作為最常用的檢測PBMC活性的方式是由于可以排除紅細胞的影響。其中AO可以通過完整的細胞膜,呈現綠色熒光;PI只能通過死細胞的細胞膜,嵌入所有死細胞的細胞核,呈現紅色熒光。但使用細胞計數儀無法排除當細胞冷凍復蘇后,由于凍存時候小冰晶的影響,可能導致細胞膜上面有穿孔,但又不至于導致細胞死亡的情況。但實際上,這種細胞在后續實驗過程中效果會非常差。因而我們建議在質檢中加入復蘇第二天的LDH檢測。

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二、同批次之間的管間差

現階段分離PBMC的原料一般是Leukopak,關于Leukopak與全血的分離的區別如下:

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這樣會導致一個問題,每次分裝的細胞管數量過多,然后凍存液是非常粘性的,沒有辦法在分裝中不停的去吹打混勻,這必然導致在分裝過程中出現很明顯的管間差,可以這么講,第一管和最后一管基本上不論是細胞數量還是細胞組成其實都會有很大區別,這也是大家在使用過程中經常碰到的為什么我明明用的是同一個批次同一個規格,但重復出來的結果卻有很大差異。我司經過反復的摸索,現階段終于有效的解決了此問題,如下:

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1. Baust, J. M., et al. (2001). "A molecular basis of cryopreservation failure and its modulation to improve cell survival." Cell Transplant 10(7): 561-571.

2. Book_Biobanking And Cryopreservation.


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